TEKNIK ENUMERASI KOLONI SEL BAKTERI 0

I.       PENDAHULAN

            Dalam kebutuhan di berbagai bidang, kita membutuhkan mikroba untuk dikembangbiakkan di dalam suatu medium. Penanaman dan pertumbuhan mikroba tersebut dinamakan pembiakan mikroba. Pemeliharaan mikroba dilakukan secara in- vitro.  Penanaman  ini dilakukan dengan tujuan untuk memperbanyak pertumbuhan mikroba tersebut. Proses ini tentu tidak lepas begitu saja dari kebutuhan hidup mikroba, sehingga penanaman membutuhkan penyediaan nutrien yang terdiri dari campuran bahan-bahan hara yang sangat berguna untuk perkembangan mikroba dan menunjang kehidupan mikroba yang dibiakkan. Penyediaan bahan-bahan makanan ini disebut juga sebagai medium pertumbuhan. Dengan menggunakan macam-macam medium dapat dilakukan isolasi, perbanyakan, pengujian sifat-sifat fisiologis dan penentuan jumlah mikroba. (Suriawiria, 1985)

II.    MAKSUD DAN TUJUAN

Adapun maksud dan tujuan disusunnya laporan ini adalah sebagai berikut:

·         Untuk menentukan jumlah bakteri per ml bahan.

·         Untuk mengetahui cara penentuan jumlah bakteri menggunakan lempeng pembiakan (plate count).

III.       IDENTIFIKASI MASALAH

·         Hasil perhitungan bakteri dalam lempeng pembiakan.

·         Mengapa penentuan jumlah bakteri diambil dari tiaga pengenceran terakhir.

·         Mengapa pada penambahan agar setelah suspensi bakteri dituangkan pada suhu 40^o C.

IV.       TINJAUAN PUSTAKA

                     Karena keperluan berbagai bidang, manusia membutuhkan mikroba untuk dikembangbiakkan di dalam suatu medium. Penanaman dan pertumbuhan mikroba tersebut dinamakan pembiakan mikroba. Dengan menggunakan macam-macam medium dapat dilakukan isolasi, perbanyakan, pengujian sifat-sifat fisiologis, dan penentuan jumlah mikroba. (Suriawiria, 1985)

                     Di dalam suatu populasi bakteri tidak semua sel mampu selalu hidup.Yang dianggap sel hidup yaitu sel yang mampu membentuk koloni di dalam agar biakan atau membentuk suspensi dalam larutan biak. Sel-sel yang dapat mampu terus hidup inilah yang dihitung dengan berbagai metode untuk menetapkan jumlah sel hidup. Pada jumlah total sel ikut dihitung semua sel yang nampak atau dapat dihitung dengan cara lain, sel-sel mati dan cacat ikut dihitung. (Suriawiria, 1985)

                     Pertumbuhan yang artinya bertambahnya secara kuantitas populasi (bertambah banyak) dapat ditentukan dengan berbagai cara yang didasarkan atas satu atau tipe pengukuran bakteri berikut ini:

·               Penghitungan sel

Dapat dilakukan langsung secara mikroskopi atau dengan menggunakan alat penghitung bakteri secara elektronik atau secara tidak langsung dengan menghitung koloni.

·               Penimbangan massa sel

Penimbangan langsung, atau dengan menakar nitrogen sel atau secara tidak langsung dengan mengukur tingkat kekeruhan.

·               Pengukuran aktivitas sel

Pengukuran secara langsung dengan menghubungkan derajat aktivitas biokimia dengan suatau populasi.

(Usman, 1987)

Penghitungan bakteri dapat diklasifikasikan menjadi 2, yaitu: menghitung secara langsung, menghitung secara tidak langsung dan penghitungan bakteri hidup.

a.      Menghitung secara langsung

Bakteri dapat secara mudah dan cermat dihitung dalam bilik hitung Petroff-Hausser, terdiri dari kaca objek khusus bergaris cermat bentuk kotak-kotak dengan luas 1/400 mm²; diatasnya dapat diletakkan kaca penutup dengan jarak 1/50 mm sehingga volume tiap kotak adalah 1/20.000 mm³. Dalam bilik ini dapat dihitung bakteri tanpa pengecatan dengan mikroskop fase-kontras. Bila biasanya terdapat 5 buah bakteri dalam tiap kotak maka jumlah bakteri adalah 5 x 20.000.000 atau 10⁸. Kelemahan cara ini ialah bila bilangan bakteri dalam suspensi itu rendah maka penghitungan menjadi tidak cermat Cara menghitung langsung ini menghasilkan hitungan total karena semua sel terhitung yang hidup maupun yang mati. Karena bakteri itu sangat kecil, maka untuk hitungan secara statisti dapat diterima, harus dibuat suspensi terlebih dahulu sekurang-kurangnya 10⁷ bakteri per mililiter. Penghitungan bakteri secara langsung dapat diklasifikasikan menjadi 2, yaitu:

·         Menghitung dari preparat pengecatan

               Cara inipun menghasilkan hitungan total. Sejumlah volume dioeskan pada luas kaca objek yang telah diukur, dicat dengan metilen biru atau cat lain yang sesuai kemudian dihitung jumlah organisme pada bagian tertentu yang telah diketahui luasnya. Dengan mengetahui diameter bidang penglihatan dengan pengukuran sebelumnya (dengan stage micrometer) aka jumlah per milimeter dapat dihitung.

·         Menghitung dengan filter membran

               Contoh air yang telah ditakar disaring dengan filter steril yang terbuat dari membran berpori halus yang tidak meloloskan bakteri dengan demikian bakteri tertahan oleh filter an setelah dicat langsung dihitung. Dalam hal ini jumlah bakteri dalam cairan itu tidak boleh terlalu banyak dan tersebar rata. Untuk menghitung membran diuat transparan dengan menyerapkan minyak imersi ke dalam membran itu. Cara ini menghasilkan hitungan total.

·         Menghitung dengan alat penghitung elektronik

               Dengan alat ini dapat dihitung beribu-ribu bakteri dalam beberapa etik saja. Penggunaan  alat ini didasarkan atas kerja dengan lubang pengintai elektronik. Kerjanya bergantung pada interupsi bekas cahaya elektronik yang melintasi ruang antara dua elektronik yang melintasi ruang antara dua elektrode yang berdekatan letaknya. (Usman, 1987)

b.      Menghitung secara tidak langsung

               Cara ini dapat dilakukan dengan 2 cara, antara lain: penentuan volume total dan metode turbidometri.

·         Penentuan volume total

               Cara ini adalah semacam modifikasi penentuan hematokrit pada pengukuran volume total butir-butir darah. Misalnya 10 ml biakan dimasukkan ke dalam tabung reaksi khusus atau disebut juga tabung hopkins yang bagian bawahnya berupa silinder dan bergaris ukuran. Organisme didapatkan dengan sentrifus pada kecepatan baku dan waktu yang tepat menurut ukurannya, kemuian volume totalnya dapat dibaca pada skala silindernya.Dengan mengetahui rata-rata masing-masing sel secara perkiraan dapat ditentukan jumlah sel.

·         Metode turbidometri

            Teknik ini sudah dipakai sebagai cara mengukur kekeruhan suspensi atas dasar penyerapan dan pemancaran cahaya yang dilintaskan sehingga suspensi yang mengandung lebih dari 10⁷- 10⁸ sel per milimeter. Kelemahan cara ini ialah bahwa kesalahan dapat terjadi karena variasi dalam ukuran dan bentuk serta penggumpalan sel-sel. Juga karena perbedaan derajat tembus cahaya bermacam-macam spesies atau bahan lain dalam biakan tersebut. Tetapi cara ini merupakan salah satu cara tercepat yang paling sederhana serta cukup teliti. Dan cara ini tidak bisa menentukan jumlah bakteri secara eksponen bilangan sel, melainkan kekeruhan dapat dibakukan dalam sebutan jumlah sel dari penghitungan dalam hemasitometer dengan bilangan suspensi bakteri baku . (Usman, 1987)

c.       Standard Plate Count (SPC)

            Penghitungan bakteri hidup dilakukan dengan cara pengenceran terhadap sampel tertentu. Cara ini digunakan secara luas untuk menghitung bakteri hidup dalam bermacam-macam cairan dan padatan. Untuk keperluan ini dibuat sederetan pengenceran kemudian menanam tiap pengenceran tersebut ke dalam medium pertumbuhan agar dan setelah pengeraman jumlah koloni dihitung. Setelah dikonversi sesuai dengan pengencerannya akan diketahui jumlah bakteri per mililiter. Dalam melaksanakan pengenceran perlu diperhatikan bahwa bilangan optimal kira-kira 30-300 koloni sehingga pengenceran harus disesuaikan dengan perkiraan memperoleh bilangan ini. (Brown, 2005)

V.          ALAT, BAHAN DAN PROSEDUR PERCOBAAN

            Alat dan Bahan Percobaan

            Alat Percobaan

·         Cawan petri

·         Inkubator

·         Korek api

·         Labu erlenmeyer

·         Pembakar spirtus

·         Tabung reaksi

·         Volum pipet

            Bahan Percobaan

·         Plate Count Agar (PCA)

·         Potato Dextrose Agar (PDA)

·         NaCl fisiologis

·         Sampel tanah depan gedung D2

             Prosedur Percobaan

            Pengenceran Sampel tanah

·         Sampel tanah sebanyak 2,25 gram ditimbang

·         Sampel tanah dimasukkkan ke dalam NaCl fisiologis 9 ml yang ada di tabung reaksi.

·         Selanjutnya, diaduk perlahan suspensi I tersebut.

·         Lalu, diambil 1 ml suspensi I dengan menggunakan volum pipet lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi lain berisi NaCl fisiologis  diaduk perlahan kembali. Diberi nama tabung reaksi tersebut suspensi II.

·         Selanjutnya, diambil 1 ml suspensi I dengan menggunakan volum pipet lalu dimasukkan ke dalam tabung reaksi lain berisi NaCl fisiologis  diaduk perlahan kembali. Diberi nama tabung reaksi tersebut suspensi III.

·         Pengenceran tersebut dilakukan secara berulang kali hingga pengenceran yang ke-9 dan diberi nama suspensi XI.

        

5.2.2. Menggunakan media PCA (Plate Count Agar)

·         Suspensi dari sampel masing-masing dibuat.

·         Dilakukan pengenceran terhadap masing-masing sampel. (Sampel tanah, dilakukan sampai 9 kali pengenceran).

·         Tiga pengenceran terakhir, masing-masing dituangkan sebanyak 1 ml ke dalam cawan petri. Pada saat penuangan bahan yang sudah diencerkan dilakukan dekat api.

·         Ke dalam cawan petri dimasukkan Plate Count Agar cair sebanyak 20 ml pada suhu kurang lebih 40^o C.

·         Medium diaduk perlahan agar bahan pengenceran dan agar nutrisi homogen.

·         Sesudah agar nutrisi beku, cawan petri dibalik secara hati-hati.

·         Cawan petri berisi Plate Count Agar dan bahan pengenceran yang sudah beku, diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37^o C.

·         Setelah 2 hari (48 jam) diamati dan dihitung jumlah koloni tersebut.

5.2.2. Menggunakan media PDA (Potato Dextrose Agar)

·         Suspensi dari sampel masing-masing dibuat.

·         Dilakukan pengenceran terhadap masing-masing sampel. (Sampel tanah dilakukan sampai 9 kali pengenceran).

·         Tiga pengenceran terakhir, masing-masing dituangkan sebanyak 1 ml ke dalam cawan petri. Pada saat penuangan bahan yang sudah diencerkan dilakukan dekat api.

·         Ke dalam cawan petri dimasukkan Potato Dextrose Agar cair sebanyak 20 ml pada suhu kurang lebih 40^o C.

·         Medium diaduk perlahan agar bahan pengenceran dan agar nutrisi homogen.

·         Sesudah Potato Dextrose Agar beku, cawan petri dibalik secara hati-hati.

·         Cawan petri berisi agar nutrisi dan bahan pengenceran yang sudah beku, diinkubasi selama 24 jam dengan suhu 37^o C.

·         Setelah 4 hari (96 jam) diamati dan dihitung jumlah koloni tersebut.

VI.       HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1. Hasil :

Plate Count Agar (PCA) pengamatan 24 jam

Pengeceran 10-7                                                                                            Jumlah: 18 koloni

Pengenceran 10-8                                                                                          Jumlah: 28 koloni

Pengenceran 10-9                                                                                             Jumlah: 25 koloni

Plate Count Agar (PCA) pengamatan 48 jam

Pengeceran 10-7                                                                                                Jumlah: 21 koloni

Pengenceran 10-8                                                                                          Jumlah: 33 koloni

Pengenceran 10-9                                                                                            Jumlah: 25 koloni

Potato Dextrose Agar (PDA) pengamatan 48 jam

Pengeceran 10-7                                                                                               Jumlah: 2 koloni

Pengenceran 10-8                                                                                                                                                                             Jumlah: 2 koloni

Pengenceran 10-9                                                                                                                                                                             Jumlah: 2 koloni

4.2. Jumlah koloni:

PCA

Hari ke-1 (24 jam)
Pengenceran 10-7	Pengenceran 10-8	Pengenceran 10-9
18 koloni	28 koloni	25 koloni

  

Hari ke-2 (48 jam)
Pengenceran 10-7	Pengenceran 10-8	Pengenceran 10-9
21 koloni	33 koloni	25 koloni

  

PDA

Hari ke-4 (96 jam)
Pengenceran 10-7	Pengenceran 10-8	Pengenceran 10-9
2 koloni	1 koloni	0 koloni

4.3. Perhitungan:

                  Pada PCA, koloni bakteri tidak dapat dihitung, penghitungan  hanya digunakan untuk bakteri yang jumlahnya koloninya berkisar 30-300 buah koloni. Sedangkan pada data pengamatan hari ke-2 (48 jam) pada pengenceran 10^-7 dan pengenceran 10^-9 jumlahnya koloninya kurang dari 30 buah koloni. Hal ini disebabkan karena terlalu sering dilakukan pengenceran, yaitu sampai 9 kali pengenceran sehingga koloni bakteri kurang dari 30 buah, maka metode penentuan jumlah bakteri tidak digunakan.

                  Pada PDA koloni jamur dapat dihitung, tidak seperti koloni bakteri. Karena syarat dengan metode penentuan jumlah seperti rumus diatas tidak berlaku pada jamur. Maka perhitungan dilakukan sebagai berikut:

Jumlah jamur / ml bahan yang diperiksa =

(2 x 10⁷ ) + (1 x 10⁸ ) + (0 x 10⁹ )       20.000.000 + 100.000.000 + 0

____________________________ = ________________________ =

                              3                                                    3

120.000.000

__________ = 40.000.000 buah

         3

                 

                  Komponen-kompenen anorganik dalam tanah memungkikan untuk berbagai oragnisme hidup didalam tanah. Contoh ikroorganisme yang biasa hidup di tanah antara lain: bakteri, jamur, ganggang, dan protozoa. (Dwidjoseputro, 2005). Bakteri merupakan kelompok organisme paling dominan dalam tanah. Bakteri yang paling umum yang berada pada tanah ialah genus Pseudomonas, Arthrobacter, Clostridium, Achromobacter, Bacillus, Micrococcus, Flavobacterium ,Nitrobacter, Nitrosomonas, Corynibacterium, Sarcina, dan Mycobacterium. Sedangkan jamur yang umumnya terdapat dalam tanah ialah genus Acrostalagamus, Aspegillus, Botrytis, Cephalosporium, Glicocladium, Monilla, Penicillium, Scopulariopsis, Spicaria, Trichodrma, Trichothecium, Vetricillium, Altenaria, Cladosporium, Pullularia, Cylindrocarpon, Fusarium Absidia, Cunninghamella, Mortierella, Mucor, Rhizopus, Zygorynchus, dan Phythium. (Rao, 1994)

                  Penentuan jumlah bakteri diambil dari tiga pengenceran karena konsentrasi jumlah bakterinya sudah tidak telalau tinggi, sehingga mudah untuk dilakukan penghitungan. Jika diambil dari pengenceran awal konsentrasi bakteri terlalu tinggi dan sulit dilakukan penghitungan koloninya.

                  Pada saat penambahan agar pada cairan yang akan ditentukan jumlah bakterinya dilakukan pada suhu 40^o C karena suhu merupakan suhu optimum untuk pertumbuhan bakteri dan agar tersebut masih dalam keadaan cair saat dituangkan ke dalam cawan petri.

VII.    KESIMPULAN

·         PCA ialah medium agar yang dapat digunakan untuk pertumbuhan bakteri.

·         PDA ialah medium agar yang dapat digunakan untuk pertumbuhan bakteri dan jamur.

·         Bakteri yang paling umum yang berada pada tanah ialah genus Pseudomonas, Arthrobacter, Clostridium, Achromobacter, Bacillus, Micrococcus, Flavobacterium, Nitrobacter, Nitrosomonas, Corynibacterium, Sarcina, dan Mycobacterium.

·        Jamur yang umumnya terdapat dalam tanah ialah genus Acrostalagamus, Aspegillus, Botrytis, Cephalosporium, Glicocladium, Monilla, Penicillium, Scopulariopsis, Spicaria, Trichodrma, Trichothecium, Vetricillium, Altenaria, Cladosporium, Pullularia, Cylindrocarpon, Fusarium Absidia, Cunninghamella, Mortierella, Mucor, Rhizopus, Zygorynchus, dan Phythium.

·        Penentuan jumlah bakteri diambil dari tiga pengenceran karena konsentrasi jumlah bakterinya sudah tidak telalau tinggi.

·        Penambahan agar pada suspensi pengenceran dilakukan pada suhu 40^o C karena suhu merupakan suhu optimum untuk pertumbuhan bakteri dan agar tersebut masih dalam keadaan cair saat dituangkan ke dalam cawan petri.

DAFTAR PUSTAKA

Brown, A.E. 2005. Benson’s Microbiological Appllications complete version:         Laboratory Manual in General Microbiology, ninth edition. USA: Mc Graw             Hill.

Dwidjoseputro, D.2005. Dasar- dasar Mikrobiologi. Jakarta: PT Penerbit   Djambatan.

Pelczar, M J. dan E.C.S Chan. 1986. Dasar- dasar Mikrobiologi Jilid 1 Jakarta: UI            Press.

Rao, N. S. S. 1994. Mikroorganisme Tanah dan Pertumbuhan Tanaman Edisi Kedua.         Jakarta: UI      Press.

Suriawiria, U. 1985. Pengantar Mikrobiologi Umum. Bandung: Penerbit Angkasa

Usman, R. 1987. Mikrobiologi Dasar. Jatinangor: FMIPA UNPAD.