pewarnaan gram 0

PEWARNAAN GRAM

I.                   PENDAHULAN

                  Pewarnaan diferensial merupakan teknik pewarnaan yang menampilkan perbedaan di antara sel-sel mikroba atau bagian-bagian sel mikroba. Teknik pewarnaan ini menggunakan tidak hanya satu jenis larutan zat warna, berbeda dengan teknik pewarnaan sederhana (pewarnaan tunggal) yang hanya menggunakan satu jenis zat warna saja. Pewarnaan Diferensial banyak jenisnya, antara lain ialah pewarnaan gram, pewarnaan spora, pewarnaan tahan asam, pewarnaan giemsa, pewarnaan kapsul, dan pewarnaan flagel. Pada praktikum kali ini, digunakan  teknik pewarnaan gram. Dalam proses pewarnaan gram, olesan bakteri yang terfiksasi dikenai larutan gentian violet, larutan lugol, alkohol 96% (bahan pemucat), dan air fuchsin (atau zat warna tandingan lainnya). Bakteri yang diwarnai dengan teknik pewarnaan gram ada dua macam, yaitu: bakteri gram positif (bakteri berwarna ungu) dan bakteri gram negatif (kehilangan warna ungu saat diberi pewarnaan dan sewaktu diberikan zat warna tandingan lain bakteri menjadi berwarna merah).

II.                MAKSUD DAN TUJUAN

            Adapun maksud dan tujuan disusunnya laporan ini adalah sebagai berikut  :

·         Untuk memenuhi tugas praktikum mikrobiologi dasar

·         Untuk mengenal dan mempelajari pewarnaan bakteri secara diferensial

·         Untuk mengenal, mempelajari, dan mempraktekan pewarnaan gram bakteri

III.             IDENTIFIKASI MASALAH

·         Bagaimana bentuk sel, rangkaian, dan warna bakteri Escherichia coli dan Streptococcus sp. menggunakan teknik pewarnaan gram?

·         Bagaimana klasifikasi bakteri Escherichia coli dan  Streptococcus sp. berdasarkan reaksi gram!

·         Apa keuntungan pewarnaan diferensial jika dibandingkan dengan pewarnaan gram?

IV.             TINJAUAN PUSTAKA

                Cara pewarnaan diferensial yang sangat penting dalam mikrobiologi adalah pewarnaan Gram, karena reaksi Gram berkolerasi sangat baik dengan berbagai ciri penting sel. (Razali, 1987)

            Pewarnaan ini, dikemukakan oleh seorang dokter berkebangsaan Denmark, Christian Gram (1884) untuk tujuan mengenal bakteri dalam jaringan hewan. (Volk dan Wheeler, 1988)

            Gram menganggap teknik pewarnaannya sebagian gagal, karena tidak semua jenis bakteri dapat mengikkat zat tersebut. Setelah beberapa tahun demikian, baru teknik pewarnaan Gram ini disimpulkan untuk diferensiasi spesies bakteri. (Razali, 1987)

            Prosedur pewarnaan Gram diikhtisarkan sebagai berikut:

Bahan Zat Pewarna	Waktu (detik)	Gram positif	Gram negatif
Larutan karbol gentian violet " cuci dengan air " keringkan.	30	Ungu	ungu
Larutan Lugol / Iodium " cuci dengan air " keringkan	30	Ungu	ungu
Pemucatan warna oleh alkohol " cuci dengan air " keringkan	2	Ungu	warna luntur
Larutan zat warna tadingan " cuci dengan air " keringkan	30	Ungu	merah

Tabel 4.1. Prosedur pewarnaan Gram

            Bakteri yang diwarnai dengan teknik pewarnaan Gram terbagi dua golongan, yaitu: Gram positif , bila warna zat pewarna pertama (karbol gentian violet) tetap bertahan, dengan demikian warna se bakteri tampak ungu tua; dan Gram negatif, bila warna zat pewarna pertama  tidak bertahan (luntur) kemudian tercat oleh zat pewarna tandingannya, misal: air fuchsin, safranin, dan oleh zat pewarna tandingan lainnya. (Razali, 1987)

             Penyebab terjadinya dua golongan bakteri yaitu Gram positif dan Gram negatif ialah setelah diberi zat pewarna fenomenanya ini, berhubungan dengan struktur dan komposisi dinding sel. Perbedaan ketebalan antara kedua golongan itu dapat merupakan hal yang penting; dinding sel bakteri Gram negatif  pada umumnnya lebih tipis dari yang dimiliki bakteri Gram positif. Presentasi kandungan lipid bakteri Gram negatif lebih tinggi daripada Gram positif. Kenyataannya dalam eksperimen pengecatan mennjukkan bahwa perlakuan dengan alkohol mengeskstrak lipid, yang menyebabkan poisitas atau permeabilitas didding sel meningkat. Denagn demikian, kompleks karbol gentian violet dan lugol dapat disari keluar dan bakteri Gram negatif terwarnakan. Keterangan lain yang hampir sama juga mendasarkan pada perbedaan permeabilitas antara kedua golongan bakteri itu, yaitu pada bakteri Gram negatif kandungan peptidoglikan jauh lebih sedikit sehingga kerapatan jalinannya jauh lebih sedikit daripada baktri gram posiif. Pori-pori dalam peptidoglikan bakteri Gram negatif tetap masih cukup besar untuk dapat disari keluar kompleks karbol gentian violet dan lugol. Selautnya, bila sel-sel Gram psitif diperlakukan dngan lisozim untuk menyingkirkan dinding selnya, sisa strukturnya yang disebut protoplas atau sel tanpa dinding akan tercatat juga oleh kompleks karbol gentian violet dan lugol. Tetapi, sel ini mudah dihapuskan oleh alkohol. Kenyataan ini menunjukkan bahwa struktur dinding sel bakteri Gram positif itu yag menjadi tempat tertahannya zat pewarna pertama yaitu karbol gentian violet. (Razali, 1987)

Perbedaan antara bakteri Gram positif dan Gram negatif dapat dilihat melalui tabel berikut:

Bakteri Gram Positif Mengandung Mg ribonukleat Sangat sensitif terhadap zat warna trifenilmetan Sensitif terhadap penisilin Tahan basa, tidak larut dalam KOH 1% §     Kisaran isoelektrik pH 2,5-4 §  Biasanya berbentuk coccus atau batang pembentuk spora kecuali Lactobacillus  dan Cyanobacterium §  Dapat bersifat asam §  Contoh: Staphylococcus albus, Bacillus subtilis.

Bakteri Gram Negatif Tidak mengandung Mg ribonukleat Kurang sensitif terhadap zat warna trifenilmetan Sensitif terhadap Streptomisin Tidak tahan basa, larut dalam KOH 1% §     Kisaran isoelektrik pH 4,5-5,5 §  Biasanya berbentuk basil non-spora kecuali Neisseria §  Bersifat tidak tahan asam §  Contoh: Salmonella typhii, Eschericia coli.

           

V.                      ALAT, BAHAN, DAN PROSEDUR PERCOBAAN

5.1.        Alat dan Bahan Percobaan

v  Alat

§    Aquades

§    Bak Pewarnaan

§    Batang Ose

§    Kapas

§    Kertas Saring

§    Korek Api

§    Mikroskop Medan Terang

§    Object glass

§    Pembakar Spiritus

§    Pipet Tetes

§    Tabung Reaksi

§    Tissue

                                                   

v  Bahan

§  Air Fuchsin

§  Alkohol 70 %

§  Alkohol 96 %

§  Air atau aquades

§  Karbol Gentian Violet

§  Lugol

§  Minyak Imersi

§  Suspensi bakteri Escherichia coli.

§  Suspensi bakteri Streptococcus sp.

§  Xylol

5.2.      Prosedur Percobaan

Prosedur Percobaan Pewarnaan Gram Escherichia coli dan Staphylococcus sp.

·               Object glass dibersihkan dengan alkohol 70% sampai bersih agar terbebas dari lemak.

·               Object glass dipanaskan diatas pembakar spirtitus.

·               Kawat ose dipijarkan diatas pembakar spirtitus lalu didinginkan.

·               Kawat ose dicelupkan ke dalam suspensi bakteri biakan (Escherichia Coli atau Streptococcus sp.).

·               Bakteri di batang kawat ose digoreskan pada kaca preparat.

·               Preparat dikeringkan di atas hawa hangat api kemudian stelah kering difiksasi di atas nyala api sebanyak 3 kali.

·               Preparat didinginkan beberapa detik.

·               Preparat tersebut kemudian ditetesi dengan zat warna karbol gentian violet dan didiamkan selama 30 detik.

·               Zat pewarna yang berlebih dibuang lalu dicuci dengan air.

·               Preparat ditambahkan larutan lugol sebagai zat pemantek selama 30 detik.Preparat dicuci dengan air.

·               Preparat ditetesi dengan alkohol 96 % selama 2 detik sampai zat warna larut, kemudian preparat dicuci dengan air.

·               Preparat tersebut ditetesi dengan zat warna pembanding air fuchsin selama 30 detik, lalu preparat dicuci dengan air.

·               Preparat dikeringkan dan diatasnya diberi 1 tetes minyak imersi untuk menghindarkan perbedaan indeks bias.

·               Preparat diamati di bawah mikroskop.

VI.             HASIL DAN PEMBAHASAN

            Pada hasil pengamatan praktikum Pewarnaan Gram kali ini, dilakukan pengamatan bakteri  Escherichia coli dan bakteri Streptococcus sp..

1.   Escherichia coli P: 1000x Klasifikasi bakteri Escherichia coli Kingdom: Bacteria Phylum: Proteobacteria Class: Gamma Proteobacteria Order: Enterobacteriales Family: Enterobacteriaceae Genus: Escherichia Species: Escherichia coli (T. Escherich, 1885)

Streptococcus sp. P: 1000x Klasifikasi bakteri Streptococcus sp.: Kingdom: Eubacteria Phylum: Firmicutes Class: Bacilli Order: Lactobacillales Family: Streptococcaceae Genus: Streptococcus Species: Streptococcus sp.

          Foto dari hasil pengamatan memang kurang baik, sehingga tidak terlihat jelas. Pada Escherischia coli, hasil akhir menunjukkan warna bakteri ini merah kecoklatan. Hal ini benar-benar membuktikan bahwa bakteri Escherischia coli merupakan bakteri Gram positif. Bentuk Escherischia coli ini basil (batang). Pada saat pengamatan terlihat ada bakteri Escherischia coli yang terlihat berjajar 2, disebut juga diplobasil. Waktu pengamatan yang terbatas merupakan salah satu hambatan keterbatasan pengamatan. Sedangkan pada Streptococcus sp. hasil akhir menunjukkan warna bakteri ini ungu. Sehingga hal ini benar-benar mennjukkan bahwa bakteri Streptococcus sp. merupakan bakteri Gram negatif. Pada hasil pengamatan bakteri Streptococcus sp., rangkaian antai yang seharusnya terjadi pada bakteri Streptococcus sp. terpecah sehingga yang terlihat di bawah mikroskop ialah seakan-akan bakteri ini diplococcus, padahal bukan. Kemungkinan terbesarnya hal ini disebabkan penghapusan bakteri oleh kawat inokulasi saat pembuatan preparat dan suspensi bakteri dalam tabung reaksi mengalami guncangan kecil sehingga rantai yang seharusnya terbentuk menjadi pecah dan membentuk bakteri yang rangkaiannya diplococcus bahkan hanya coccus-coccus terpisah.

          Untuk zat pewarna yang digunakan pada praktikum kali ini, pewarna ppertama ialah Karbol Gentian violet lalu ditambahkan lugol yang berfunsi sebagai zat pemantek atau perekat warna kemudian zat pewarna air fuchsin. Sebenarnya untuk pewarnaan menggunakan zat pewarna air fuchsin bisa saja diganti dengan zat pewarna lain, asalkan zat pewarna yang kedua itu merupakan tandingan dari zat pewarna pertama. Waktu saat pemberian zat warna, zat pemantek, juga alkohol sebagai zat pemudar warn sebaiknya tidak kurang ataupun lebih dari waktu yang telah ditentukan. Agar hasil bakteri baik.

          Secara pengklasifikaian bakteri berdasarkan teknik pewarnaan Gram, bakteri Escherischia coli termasuk ke dalam bakteri Gram negatif dan bakteri Streptococcus sp. termasuk bakteri Gram positif.

          Sebagai perbandingan antara teknik pewarnaan tungggal dan teknik pewarnaan diferensial (yaitu termasuk pewarnaan Gram), salah satu keuntungan yang didapat dari teknik pewarnaan diferensial ini ialah dapat mengidentifikasikan bakteri tersebut ke dalam golongan bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif.

VII.          KESIMPULAN

·               Pewarnaan diferensial membutuhkan lebih dari satu zat warna.

·               Bakteri Escherischia coli termasuk ke dalam bakteri Gram negatif

·               Bakteri Streptococcus sp. termasuk bakteri Gram positif.

·               Keuntungan teknik pewarnaan Gram ialah dapat mengidentifikasikan bakteri tersebut ke dalam golongan bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif.

·               Warna ungu menunjukkan hasil bakteri Gram positif, sedangkan warna merah menunjukkan hasil bakteri Gram negatif.

DAFTAR PUSTAKA

Dwidjoseputro, D.2005. Dasar- dasar Mikrobiologi. Jakarta: PT Penerbit Djambatan.

Jawetz, E., Joseph Melnick & Edward Aldeberg.1996.Mikrobiologi Kedokteran,    diterjemahkan oleh Edi Nugroho dan R. F Maulany.Jakarta: Penerbit Buku      kedokteran EGC.

Pelczar, M J.dan E.C.S Chan.1986.Dasar- dasar Mikrobiologi Jilid 1 Jakarta: UI   Press.

Razali, U. 1987. Mikrobiologi Dasar.Jatinangor: FMIPA UNPAD.

Volk, W.A dan Margaret Fwheeler.1988.Mikrobiologi Dasar, diterjemahkan oleh:             Markham, M.sc.Jakarta: Erlangga.