TEKNIK PEMBUATAN MEDIA 0

I.       TUJUAN

Untuk mengetahui sifat-sifat pertumbuhan, mempelajari sifat-sifat fisiologis dan biokimia pada bakteri dan jamur (biakan). Serta untuk mengtehui tata cara dan bentuk-bentuk media biakan.

II.   TINJAUAN PUSTAKA

Untuk menumbuhkan dan mengembang-biakan mikroba, diperlukan suatu substrat yang disebut media. Sedang, media itu sendiri sebelum dipergunakan harus dalam keadaan steril, artinya tidak ditumbuhkan mikroba lain yang tidak diharapkan. Secara umum, media dipergunakan karena tiga alasan yaitu untuk menumbuhkan dan memelihara bakteri biakan, untuk mempelajari aktivitas mikroorganisme di dalam suatu media yang mengandung zat tertentu, serta untuk mengetahui hasil produksi dari suatu mikroorganisme terhadap satu zat spesifik atau kombinasi dari zat-zat (Sarles, 1956).

Selama tahun 1870-an, Robert Koch (1843-1910) dan peneliti-peneliti lain di laboratoriumnya membuktikan bahwa jasad renik tertentu menyebabkan timbulnya penyakit tertentu pula dan hal ini telah menuntun kepada ditetapkannya criteria yang dapat mendasari ditariknya kesimpulan semacam itu. Kriteria ini, dikenal dengan Postulat Koch, menjadi garis penunjuk dan tetap sampai kini dipakai dalam mencari bukti bahwa suatu penyakit disebabkan oleh jasad renik tertentu. Postulat Koch itu adalah

1. Mikroorganisme tertentu selalu dapat dijumpai berasosiasi dengan penyakit tertentu.

2. Mikroorganisme itu dapat diisolasi dan ditumbuhkan menjadi biakan murni di

    laboratorium.

3. Biakan murni mikroorganisme tersebut akan menimbulkan penyakit itu bila disuntikan

    pada hewan yang rentan (suseptibel).

4. Penggunaan prosedur laboratorium memungkinkan diperolehnya kembali

 mikroorganisme yang disuntikan itu dari hewan yang sengaja diinfeksikan dalam

 percobaan.

Sesuai dengan postulat Koch, maka untuk penetapan jenis bakteri penyebab suatu penyakit harus ditemukan secara murni, diselidiki sifat-sifat bakterinya untuk dideterminasi dan bila diperlukan dapat ditemukan keganasannya.

Susunan bahan, baik berbentuk bahan alami (seperti kentang, daging, dll) ataupun bahan buatan (berbentuk senyawa kimia, organik ataupun anorganik) yang dipergunakan untuk pertumbuhan dan perkembang-biakan mikroba dinamakan media.

Agar mikroba dapat tumbuh dan berkembang dengan baik di dalam media, diperlukan persyaratan tertentu, yaitu :

-    Bahwa di dalam media harus terkandung semua unsur hara yang diperlukan untuk pertumbuhan dan perkembang-biakan mikroba

-    Bahwa media harus mempunyai tekanan osmosa, tegangan permukaan dan pH yang sesuai dengan kebutuhan mikroba

-    Bahwa media harus dalam keadaan steril, artinya sebelum ditanam mikroba yang dimaksud, tidak ditumbuhi oleh mikroba lain yang tidak diharapkan.

Bentuk, susunan, dan sifat media ditentukan oleh senyawa penyusun media, presentase campuran dan tujuan penggunaan.

Ditentukan oleh ada tidaknya penambahan zat pemadat seperti agar-agar, gelatine, dan sebagainya maka bentuk media dikenal tiga jenis:

a. Media padat, media ini dapat berbentuk media tegak, miring, atau lempeng. Umumnya dipergunakan untuk bakteri, ragi, jamur, dan kadang-kadang juga mikroalgae

b.Media cair, yang mempunyai bentuk sesuai dengan tempat yang digunakan. Biasanya untuk pembiakan mikroalgae, tetapi ada juga untuk mikroba lain terutama bakteri dan ragi

c. Media setengah padat, yang pada umumnya berbentuk media tegak. Media ini umumnya diperlukan untuk pertumbuhan mikroba yang hanya memerlukan kandungan air dan hidup anaerobik atau fakultatif.

Bakteri dapat dibiakan dalam media mati, sedangkan virus hanya dapat dibiakan dalam media hidup (memerlukan adanya sel-sel hidup). Media pembiakan mati adalah media yang dibuat berupa :

-    Medium nutrien, yaitu medium yang sangat kaya dengan zat-zat makanan, umumnya semua bakteri dapat tumbuh. Misalnya buylon, darah, dan agar darah.

-    Medium eksklusif, yaitu medium yang memungkinkan hidup bagi jenis bakteri tertentu saja. Caranya adalah dengan menaikan atau menurunkan Ph.

-    Medium selektif, yaitu medium yang mengandung zat-zat tertentu yang oleh bakteri tertentu akan diuraikan atau diubah menjadi zat lain.

-    Medium diperkaya, yaitu medium yang mengandung zat-zat tertentu yang dapat menghambat atau mematikan bakteri lain yang tidak dicari. Sedangkan bakteri yang dicari akan hidup subur. Misalnya Tetrahionat Breelian Green, medium ini disebut juga sebagai medium persemaian.

Sedangkan media pembiakan hidup adalah:

-                      Binatang-binatang percobaan,  misalnya marmot, tikus, kelinci, dan lain-lain

-                      Tissue culture (media/kultur jaringan hidup)

-                      Embryonated egg (telur bertunas)

Sesuai dengan fungsi fisiologis dari masing-masing komponen (unsur/hara) yang terdapat di dalam media, maka susunan media pada semua jenis mempunyai kesamaan isi, yaitu :

-                      Kandungan air

-                      Kandungan nitrogen, baik berasal dari protein, asam amino dan senyawa lain yang

mengandung nitrogen

-                      Kandungan sumber energi/unsur C, baik yang berasal dari karbohidrat, lemak, protein,

ataupun senyawa-senyawa lain

-                      Faktor pertumbuhan, umumnya vitamin dan asam amino.

Berdasarkan persyaratan tersebut, susunan media dapat berbentuk :

a.       Media alami, yaitu media yang disusun oleh bahan-bahan alami seperti kentang, tepung, daging, telur, ikan, umbi-umbian, dan lain sebagainya.

b.      Media sintesis atau media sintetik, yaitu media yang disusun oleh senyawa kimia. Medium ini mengandung zat yang telah diketahui kadar di dalamnya.

c.       Media semi sintesis, yaitu media yang tersusun oleh campuran-campuran bahan alami dan bahan sintesis tetapi tidak diketahui dengan pasti kadar yang ada di dalamnya.

d.      Media non sintetik, medium ini hanya terdiri dari satu macam zat kimia.

III.     METODOLOGI PENELITIAN

III.1 Alat dan Bahan

Glukosa

-          tabung reaksi

-          tabung Durham

-          pipet tetes

-          1 gr gula

-          100 cc air pepton

-          0,02% fenol red

Laktosa    

-          tabung reaksi

-          tabung Durham

-          pipet tetes

-          1 gr gula

-          100 cc air peptone

-          0,02% fenol red

Mannosa

-          tabung reaksi

-          Erlenmeyer

-          Tabung Durham

-          Pipet tetes

-          0,75 gr mannosa

-          75 ml air pepton

-          fenol red

-          KOH

Maltosa

-          tabung reaksi

-          tabung Durham

-          pipet tetes

-          1 gr gula

-          100 cc air peptone

-          0,02% fenol red

Sakarosa

-          18 tabung reaksi

-          18 tabung Durham

-          18 sumbat tabung

-          erlenmeyer

-          pipet tetes

-          spatula

-          0,75 gr sakarosa

-          75 ml air pepton

-          fenol red + NaOH

Semi Solid

-          4 gr agar

-          5 gr NaCl

-          5 gr baktopepton

-          1 L aquades

Simon Citrat

-          tabung reaksi 22 buah

-          erlenmeyer

-          sumbat tabung

-          rak tabung

-          batang pengaduk

-          Simon Citrat

-          agar

-          aquades 100 ml

Air Pepton

-          tabung reaksi

-          pipet tetes

-          gelas ukur 250 ml

-          erlenmeyer 1000 ml

-          6 gr pepton

-          3 gr NaCl

-          600 ml air

Urea 100 ml

-          labu erlenmeyer

-          tabung reaksi

-          tabung Durham

-          pipet tetes

-          gelas ukur

-          0,1 gr sukrosa

-          0,1 gr pepton

-          0,5 gr NaCl

-          0,2 gr KH₂PO₄

-          fenol red

-          2 gr agar

-          100 ml aquades

Voges Proskauer (VP)

-          18 buah tabung reaksi

-          erlenmeyer 150 ml

-          sumbat tabung

-          0,375 gram baktopepton

-          0,375 gram glukosa

-          0,375 gram KH₂PO₄

-          75 ml aquades

Methyl Red (MR)

-          18 buah tabung reaksi

-          erlenmeyer + sumbat

-          0,5 gr baktopepton

-          0,5 gr glukosa

-          0,5 gr K₂HPO₄

-          100 ml aquades

TSIA

-          tabung reaksi + sumbat

-          labu erlenmeyer

-          volum pipet

-          batang pengaduk

-          beaker glass

-          penangas air

-          2 gr pepton

-          0,3 gr beef extract

-          0,5 gr NaCl

-          2% agar-agar

-          100 ml aquades

-          NaOH 1N 12 cc/lt

-          fenol red

-           0,1 gr glukosa

-          0,1 gr laktosa

-          0,1 gr glukosa

-          0,1 gr laktosa

-          0,1 gr sakarosa

-          20 mg Ferri Amonium sulfat

-          1 ml Na Thiosulfat 2%

Urea 40 % dalam 50 ml

-          labu erlenmeyer + sumbat

-          20 gr urea

-          50 ml aquades

Laktosa Broth 1,5 L

-          tabung reaksi

-          tabung Durham

-          pipet tetes

-          15 gr laktosa

-          1500 ml air pepton

-          beberapa tetes fenol red

Eschercia coli medium

-          medium E.C. 37 gr

-          aquades 1 lt

Breeliant Green

-          medium BG 22 gr

-          aquades 1 lt

III.2 Tata Kerja

Glukosa

Air pepton dimasukan ke dalam erlenmeyer . Lalu gula dimasukan (diaduk dengan batang pengaduk). Fenol red ditambahkan. Larutan tersebut dimasukan ke dalam tabung reaksi, tabung Durham juga dimasukan dalam keadaan terbalik. Tidak ada udara pada tabung Durham. Tabung agak dimiringkan untuk menghilangkan gelembung udara dalam tabung Durham. Masing-masing tabung reaksi ditutup dengan menggunakan sumbat tabung. Setelah itu, semua tabung tersebut dibungkus dengan kertas lalu dimasukan ke dalam otoklaf.

Laktosa

Air pepton dimasukan ke dalam erlenmeyer . Lalu gula dimasukan (diaduk dengan batang pengaduk). Fenol red ditambahkan. Larutan tersebut dimasukan ke dalam tabung reaksi, tabung Durham juga dimasukan dalam keadaan terbalik. Tidak ada udara pada tabung Durham. Tabung agak dimiringkan untuk menghilangkan gelembung udara dalam tabung Durham. Masing-masing tabung reaksi ditutup dengan menggunakan sumbat tabung. Setelah itu, semua tabung tersebut dibungkus dengan kertas lalu dimasukan ke dalam otoklaf.

Mannosa

Mannosa dan air pepton dilarutkan. Lalu ditambahkan fenol red dan KOH. Tabung Durham dimasukan dalam tabung reaksi dan diusahakan tidak ada udara. Larutan dari erlenmeyer dimasukan ke dalam tabung reaksi. Tabung reaksi ditutup dengan menggunakan sumbat tabung. Lalu dibungkus dengan kertas koran dan dimasukan ke dalam otoklaf.

Maltosa

Air pepton dimasukan ke dalam erlenmeyer . Lalu gula dimasukan (diaduk dengan batang pengaduk). Fenol red ditambahkan. Larutan tersebut dimasukan ke dalam tabung reaksi, tabung Durham juga dimasukan dalam keadaan terbalik. Tidak ada udara pada tabung Durham. Tabung agak dimiringkan untuk menghilangkan gelembung udara dalam tabung Durham. Masing-masing tabung reaksi ditutup dengan menggunakan sumbat tabung. Setelah itu, semua tabung tersebut dibungkus dengan kertas lalu dimasukan ke dalam otoklaf.

Sakarosa

75 ml air pepton dimasukan ke dalam erlenmeyer. Lalu 0,75 gr sakarosa dimasukan dan diaduk hingga rata. Ditambahkan ke dalam larutan tersebut, fenol red serta NaOH sampai warnyanya merah. Larutan dari erlenmeyer dimasukan ke dalam tabung reaksi secukupnya, kemudian tabung Durham dimasukan ke dalam tabung reaksi yang sudah terisi. Tabung agak dimiringkan untuk menghilangkan gelembung udara dalam tabung Durham. Masing-masing tabung reaksi ditutup dengan menggunakan sumbat tabung. Setelah itu, semua tabung tersebut dibungkus dengan kertas lalu dimasukan ke dalam otoklaf.

Semi Solid

                        Agar, NaCl, baktopepton, aquades dicampurkan. Lalu larutan tersebut dipanaskan.

Simon Citrat

Simon Citrat, agar, dan 100 ml aqudes dicampur. Lalu diaduk dan dipanaskan dalam air mendidih sampai larutan tersebut homogen. Bila sudah panas, maka larutan tersebut dapat dituangkan ke dalam tabung reaksi seperempat sampai setengah dari tinggi tabung. Lalu ditutup dengan sumbat tabung. Tabung tersebut dimiringkan sebelum agar mengeras. Bila sudah mengeras, dibungkus dengan koran dalam keadaan tegak dan disimpan dalam otoklaf pada suhu 120ºC selama 20 menit pada tekanan 1 atm, pH ditentukan 6,8 – 7,2.

Air pepton

Semua zat dipanaskan dalam erlenmeyer sampai larut, bila perlu disaring. Setelah larut, larutan tersebut dipindahkan ke dalam tabung reaksi. pH ditentukan 6,8 – 7,2 kemudian disterilkan dalam otoklaf 120ºC selama 20 menit pada tekanan 1 atm

Urea 100 ml

Labu erlenmeyer disiapkan dan diisi dengan aquades 100 ml yang sudah diukur dengan gelas ukur. Bahan-bahan kecuali fenol red dimasukan. Larutan tersebut dikocok hingga homogen. Fenol red dimasukan seperlunya sampai warna larutan pink kemerahan. Labu erlenmeyer disumbat lalu dibungkus dengan kertas koran. Disterilisasi dengan menggunakan otoklaf. Lalu dipindahkan  ke tabung reaksi.

Voges Proskauer (VP)

Semua bahan ditimbang dan dimasukan ke dalam erlenmeyer dan dipanaskan sampai larut. pH ditentukan 7,0 – 7,2. Larutan disaring dan dimasukan dalam tabung-tabung reaksi. Bagian atas tabung disumbat, lalu dibungkus dengan kertas alumunium foil atau dengan kertas koran pada keadaan tegak agar tidak tumpah. Kemudian disterilkan dengan menggunakan otoklaf pada 110ºC selama 10-15 menit pada tekanan 1 atm.

Methyl Red (MR)

Semua bahan ditimbang dan dimasukan ke dalam erlenmeyer dan dipanaskan sampai larut. pH ditentukan 7,0 – 7,2. Larutan disaring dan dimasukan dalam tabung-tabung reaksi. Bagian atas tabung disumbat, lalu dibungkus dengan kertas alumunium foil atau dengan kertas koran pada keadaan tegak agar tidak tumpah. Kemudian disterilkan dengan menggunakan otoklaf pada 110ºC selama 10-15 menit pada tekanan 1 atm.

TSIA

Labu erlenmeyer disiapkan. Semua bahan kecuali fenol red dan beef extract dimasukan. Larutan diaduk dengan batang pengaduk hingga homogen. Sebelum dipanaskan, fenol red dan beef extract dimasukan ke dalam larutan. Larutan dipanaskan sampai berubah warnanya menjadi coklat muda. Larutan dimasukan ke dalam tabung reaksi dengan posisi tabung miring, Lalu didiamkan hingga dingin. Setelah dingin, tabung reaksi disumbat dan dibungkus dengan kertas pembungkus atau kertas koran. Larutan disimpan di otoklaf.

Urea 40%

Urea dan aquades dicampurkan hingga homogen. Lalu erlenmeyer ditutup dengan sumbat dan alumunium foil dan dibungkus dengan kertas koran. Terakhir, disterilkan di otoklaf.

Laktosa Broth

Air pepton dimasukan ke dalam erlenmeyer . Lalu gula dimasukan (diaduk dengan batang pengaduk). Fenol red ditambahkan. Larutan tersebut dimasukan ke dalam tabung reaksi, tabung Durham juga dimasukan dalam keadaan terbalik. Tidak udara pada tabung Durham.

E.C. Medium

E.C. medium dan 1 L aquades dimasukan ke dalam erlenmeyer. Dipanaskan sampai larut. Larutan tersebut dimasukan ke dalam tabung reaksi yang sudah berisi tabung Durham. Tabung-tabung tersebut disumbat dan dibungkus dengan kertas koran. Lalu disimpan di otoklaf.

Breeliant Green

Semua bahan ditimbang lalu dicampurkan hingga homogen. Lalu dipindahkan ke dalam tabung reaksi. Tabung-tabung tersebut disumbat lalu dibungkus dengan menggunakan kertas koran. Lalu disimpan di otoklaf.

IV.     HASIL DAN PEMBAHASAN

            Percobaan ini dilakukan pada hari Kamis tanggal 7 Oktober 2004.

Untuk teknik pembuatan media dengan mempergunakan glukosa, laktosa, mannosa, maltosa, sakarosa, dan laktosa broth disebut juga dengan media gula-gula. Media gula-gula adalah air pepton yang ditambah gula tertentu. Tujuannya adalah untuk mengetahui apakah mikroba yang dihadapi dapat atau tidak menguraikan jenis gula yang diberikan. Bila dapat, apakah dapat membentuk gas atau tidak. Untuk medium ini dipakai air pepton, jenis gula tertentu 1%, dan indikator (fenol red) yang berguna untuk melihat ada atau tidaknya pembentukan asam. Sebelum ditanami oleh bakteri medium tersebut  berwarna merah. Apabila sudah ditanami atau terbentuk asam maka akan berwarna kuning. Hal ini terbukti dari seluruh hasil yang diperoleh praktikan, media tersebut masih steril karena berwarna merah. Selain itu juga, dipergunakan tabung Durham untuk mengetahui ada tidaknya pembentukan gas sebagai hasil penguraian gula dalam medium. Tabung Durham diletakan terbalik di dalam tabung gula sehingga gas yang terbentuk akan tertampung di dalam tabung tersebut. Sebelum dipakai, media gula-gula ini harus selalu diperiksa apakah masih steril atau tidak. Bila telah keruh atau kuning berarti media tidak dapat dipergunakan lagi. Sifat penguraian terhadap gula dari setiap mikroba adalah berlainan, dengan demikian hasil penguraian (reaksi) ini dapat dipakai untuk determinasi suatu jenis bakteri sehingga dapat ditentukan spesiesnya.

Media Methyl Red berguna untuk mengetahui adanya pembentukan asam dengan pH dibawah 4. Methyl Red adalah suatu indikator yang akan menunjukan warna merah bila pH dibawah 4. Media ini digunakan untuk pemeriksaan bakteri Coli. Bakteri Coli sangat penting pada pemeriksaan air minum dan harus dapat dibedakan terhadap Aerobacter aerogenes (Aa). Methyl merah ini juga berguna untuk pengidentifikasian bakteri gram negatif, tidak berspora, dan biasanya berbentuk tangkai, serta beberapa spesies dari kelompok Bacillus. Dari hasil yang praktikan peroleh, Methyl red memiliki warna yang keruh.

Pada media Voges Proskaur akan diselidiki apakah  bakteri yang akan ditanami nanti dapat membentuk Acethyl methyl carbinol atau tidak. Media VP ini juga memiliki fungsi yang sama dengan media MR yaitu dapat mengidentifikasi bakteri gram negatif, tidak berspora, dan biasanya berbentuk tangkai, serta beberapa spesies dari golongan Bacillus. Hasil yang diperoleh praktikan, media VG ini berwarna kuning.

Hasil yang praktikan peroleh dari pembuatan media Simon Citrat (SC) adalah media tersebut berwarna hijau. Medium ini juga digunakan untuk Differential Diagnose (DD), antara bakteri Coli dan Aerobacter aerogenes. Aerobacter aerogenes dapat hidup dengan citrat sebagai sumber C. Maka mono amonium fosfat akan digunakan sampai terurai, dari penguraian ini diantaranya adalah dihasilkan NH₃. NH₃ ini akan mengakibatkan suasan alkalis dan timbul warna biru tua terang. Medium yang tadinya berwarna hijau kebiruan bila bereaksi positif, maka akan berubah menjadi biru tua terang. Bila reaksinya negatif, maka medium akan tetap berwarna hijau kebiruan.

Mungkin genus Proteus merupakan salah satu yang terkenal dari kelompok gram negatif yang berbentuk tangkai karena kemampuannya memproduksi enzym urea dalam jumlah besar. Berikut adalah hydrolisis urea menjadi NH₃ :

Karena produksi NH₃ menaikan pH dari medium, maka akitivitas dari urea itu sendiri dapat dideteksi dari perubahan warna, indikator fenol merah menjadi ungu. Karena pada percobaan ini praktikan belum mempergunakan bakteri untuk ditanam, jadi yang diperoleh praktikan hanya dalam bentuk media steril yang berwarna merah.

Untuk hasill-hasil dari media yng lain, diperoleh :

-          Media semi solid berwarna kuning bening

-          Media air pepton berwarna coklat keruh

-     Media TSIA berwarna coklat

-          Media E.C. berwarna coklat

-          Media Breeliant Green berwarna hijau pekat

-          Media urea 40% berwarna bening dan dingin (eksoterm, mengeluarkan panas)

DAFTAR PUSTAKA

INDARWATI, IDA., RATU SAFITRI, MIA MIRANTI. 2002. Praktikum Mikrobiologi Dasar

PELCZAR, M.J. dan E.C.S CHAN. 1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi I. Jakarta: UI Press

SARLES, WILLIAM BOWEN., WILLIAM CARROL FRAIZER, JOE BRANSFORD WILSON,

STANLEY GLENN KNIGHT. 1956. Microbiology General and Applied Second Edition. New York: Harper and Brothers

SURIAWIRIA, UNUS Drs.1985. Pengantar Mikrobiologi Umum. Bandung: Penerbit Angkasa

VAN DENMARK, PAUL J., HARRY W. SEELEY JR.1971. Microbes in Action a Laboratory

Manual of Microbiology Second Edition. USA: W.H. Freeman and Company